原代人肝细胞长期培养模型评估丨全人源肝细胞三培养体系（TCS）在CYP450酶诱导研究中的应用解析

摘要在药物研发阶段细胞色素P450CYP450酶诱导研究是体外药物代谢与药物相互作用DDI评估的重要组成部分。传统原代人肝细胞PHH虽广泛应用于CYP诱导评价但在长期培养稳定性、部分CYP亚型表达维持等方面仍存在局限。本文围绕一种全人源肝细胞三培养体系TCS, Tri-Culture System系统介绍其在主要CYP酶诱导研究中的应用表现包括基础表达水平、原型诱导剂刺激后的诱导能力以及EC₅₀与Emax分析结果。研究结果表明TCS在维持肝细胞长期功能及CYP诱导能力方面表现稳定尤其在CYP2C酶诱导研究中具有一定应用潜力可为药物研发中的体外诱导模型选择提供参考。关键词全人源肝细胞三培养体系TCS原代人肝细胞PHHCYP450CYP酶诱导CYP2C酶诱导检测肝细胞诱导评估模型药物代谢研究一、引言在药物研发阶段新型化合物对主要细胞色素P450CYP酶的体外诱导潜能评估是关键环节传统方法多采用三明治培养的原代人肝细胞PHH。尽管PHH结合监管指南往往能较合理地预测临床诱导风险但对于新一代的肝细胞模型在CYP诱导评估中的表现目前仍缺乏充分认知。本研究评估了一种新型的全人源肝细胞三培养系统TCS用于检测主要CYP和核受体的基础表达水平以及在原型诱导剂处理后CYP的诱导水平。这些结果将为TCS在体外诱导研究中的进一步应用提供基础数据支持并为探索TCS能否克服PHH存在的相关挑战如CYP2C酶诱导评估难题提供重要参考。二、材料与方法1、4周培养期内基因基础表达水平的评估将原代人肝细胞PHH和饲养细胞接种到24孔胶原包被板上构建三培养体系TCS在4周培养期内的特定时间点向孔中加入Trizol试剂裂解细胞采用氯仿萃取法分离RNA使用SuperScript IV VILO试剂盒合成cDNA使用QuantStudio7实时荧光定量PCR系统上的TaqMan芯片检测法评估基因表达。与第1天的表达量相比使用ΔΔCt法计算倍数变化。2、评估CYP表达对原型诱导剂的反应将原代人肝细胞PHH和饲养细胞接种到96孔胶原包被板上构建三培养体系TCS培养至第10天向孔中加入含不同浓度原型诱导剂含0.1%二甲基亚砜的培养基表1细胞暴露于诱导剂48小时前24小时后更换新鲜培养基和诱导剂48小时后移除培养基使用mRNA Catcher PLUS纯化试剂盒收集各孔中的RNA采用Super Script IV VILO试剂盒合成cDNA通过QuantStudio7实时荧光定量PCR系统结合TaqMan探针检测法评估基因表达水平采用ΔΔCt法计算相对于溶媒对照组的倍数变化使用GraphPad Prism软件通过S型曲线拟合数据来确定Emax和EC₅₀值。表1. 针对阳性诱导剂处理后诱导潜能评估的CYP酶列表表2. 肝细胞供体1921756信息三、结果1、三培养体系TCS研究中内参基因的筛选结果显示各内参基因的Ct值存在差异图1。其中GAPDH在培养期间的Ct值具有良好的一致性因此被选为理想的内参基因。图1. 4周培养期内各内参基因表达水平的评估。每个圆点代表第1、4、7、12、17、23或30天的基因表达水平。表3. 各内参基因的Ct值统计数据2、4周培养期内TCS中CYP酶和核受体的基础表达水平如图2所示在TCS建立后的4-12天内除CYP1A1和CYP2E1外其余CYP酶和核受体的表达水平均明显升高。大多数受测基因的表达水平在培养第7-12天达到峰值因此后续的诱导研究选择在培养第10天启动。这一结果说明TCS体系能够在较长培养周期内维持较稳定的肝细胞功能状态并支持关键代谢酶与核受体的持续表达。图2. 在基础培养条件下于4周培养期内的不同时间点检测TCS中各CYP酶和核受体的基因表达水平。3、原型诱导剂暴露48小时后主要CYP酶的诱导潜能经不同浓度原型诱导剂处理48小时后TCS中所有主要CYP酶均表现出明显的诱导潜能包括CYP2C家族各亚型图3。各酶的最大诱导倍数Eₘₐₓ和半数效应浓度EC₅₀数据见表4。此外在所有主要CYP酶的测试中当诱导剂浓度达到最高值时诱导潜能均呈现下降趋势。研究结果表明TCS体系能够较好维持主要CYP酶的诱导响应能力CYP2C相关诱导研究表现较好TCS在长期培养模型中仍能维持较高代谢功能对于药物代谢与DDI研究具有一定参考意义。图3. 三培养体系TCS经不同浓度的多种原型诱导剂处理48小时后检测各CYP酶的基因表达水平。表达水平以相对于溶媒对照组的倍数变化表示n4通过将曲线限定在观察到的最高倍数变化值确定各酶的最大诱导倍数Eₘₐₓ和半数效应浓度EC₅₀。表4. 各CYP酶的最大诱导倍数Eₘₐₓ和半数效应浓度EC₅₀四、研究讨论传统PHH模型虽然被广泛用于CYP诱导研究但在长期培养过程中常会出现肝细胞功能下降CYP表达水平降低细胞状态不稳定供体差异较大等问题。而全人源TCS体系通过引入辅助饲养细胞与长期培养策略在一定程度上改善了传统模型存在的问题。从本研究结果来看大多数CYP酶表达可维持至培养后期核受体表达稳定对原型诱导剂具有明显响应CYP2C家族诱导表现较好。因此该体系在药物代谢研究CYP诱导评价DDI风险预测长期肝毒性研究肝脏体外模型研究等方向具有一定应用潜力。五、结论TCS建立后的4-12天内除CYP1A1和CYP2E1外CYP酶和核受体的表达水平明显升高大多数受测基因在TCS中的表达水平于第7-12天达到峰值主要CYP酶在TCS中均对原型诱导剂具有高度诱导性包括CYP2C酶在主要CYP酶的测试中当诱导剂浓度达到最高值时诱导潜能均有所下降。总体来看全人源肝细胞三培养体系TCS在长期培养稳定性与CYP450酶诱导研究中表现出良好应用潜力可作为体外药物代谢与诱导评价的重要研究模型之一。参考说明本文基于原代人肝细胞、CYP450酶等公开研究资料、文献、应用文章整理仅用于科研技术交流与行业信息分享。